圖 1. tau 多肽聚集對神經(jīng)突長度影響的慢性體外模型。將原代大鼠皮層神經(jīng)元 (rCortical, Sartorius) 細胞接種到 PDL 96 孔板中（2×10⁴個細胞/孔），在研究期間將其放置在 Incucyte^? 中。接種后 8 天，用 Tau 溶解物或聚集物（肝素比例 4:1，在 37 ℃ 條件下不定時旋轉(zhuǎn) 5 天）處理細胞。對神經(jīng)突生長進行自動分段和定量。Tau 聚集物造成了神經(jīng)突長度（80 ± 5 對比 166 ± 3 %，2-3 次重復）出現(xiàn)濃度依賴性降低，非聚集的 Tau，則僅在 150 μg/mL 濃度下對神經(jīng)突的形成有巨大抑制作用。

圖 2.在帕金森病動力學模型中，羥多巴胺 (6-OHDA) 處理后細胞死亡增加同時神經(jīng)突生長減少。將大鼠原代紋狀體和星形膠質(zhì)細胞的共培養(yǎng)后接種到涂覆有 PDL 的 96 孔板中（密度分別為 2×10⁴ 和 1.5×10⁴個細胞/孔），并使用 Incucyte^? Neurolight-橙色慢病毒試劑 (Sartorius) 進行感染。在含細胞凋亡標志物 Incucyte^? Annexin V綠色染料（0.5%；Sartorius）的培養(yǎng)基中，使用 6-OHDA (2-500 μM) 處理感染 10 天后的培養(yǎng)細胞。使用 Incucyte^? 活細胞分析系統(tǒng)實時獲取熒光圖像。典型圖片顯示了用 6-OHDA（19、56 和 167 μM）和溶劑分別處理 21 天后的比較結(jié)果。時間進程和藥物反應曲線顯示，神經(jīng)突長度（橙色）的濃度依賴性降低，伴隨相應的Annexin V 信號（綠色）增強，表明了藥物的決定性作用。數(shù)據(jù)表示為平均值± SEM（3 次重復測定）。

圖 3.帕金森病模型中的大腦區(qū)域特異性：與皮層區(qū)域相比，6-OHDA 可選擇性地影響黑質(zhì)和紋狀體神經(jīng)突生長。將大鼠原代紋狀體、黑質(zhì)或皮層神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞的共培養(yǎng)后接種到涂覆有 PDL 的 96 孔板中（密度分別為2×10⁴ 和 1.5×10⁴個細胞/孔），并使用 Incucyte^? Neurolight橙色慢病毒試劑 (Sartorius) 進行感染。用 6-OHDA (56-500 μM) 處理感染 10 天后的培養(yǎng)細胞。使用 Incucyte^? 活細胞分析系統(tǒng)實時獲取熒光圖像。柱狀圖和藥物反應曲線顯示，藥物對不同腦區(qū)的神經(jīng)突長度（橙色）的選擇性作用。溶劑數(shù)據(jù)表明了不同大腦區(qū)域神經(jīng)突形成的差異性發(fā)育。數(shù)據(jù)表示為平均值± SEM（3 次重復測定）。

圖 4.功能評估結(jié)果表明，盡管 Tau 能夠保持神經(jīng)元的連接，但卻誘導了神經(jīng)元活動的喪失。將大鼠皮層神經(jīng)元和大鼠星形膠質(zhì)細胞 (Neuroprime^?, Sartorius) 接種到鋪有 PDL 的 96 孔板中（密度分別為2×10⁴ 和 1.5×10⁴個細胞/孔）進行共培養(yǎng)。使用基因編碼的鈣指示劑 Incucyte^? Neuroburst橙色慢病毒 (Sartorius) 感染神經(jīng)元，通過測試鈣的波動來監(jiān)測自發(fā)的神經(jīng)元活動。在 Incucyte^? 中，每 24 小時采集一次圖像（以 3 幀每秒的速率掃描 3 分鐘）。細胞成熟功能性網(wǎng)絡形成（14 天）后，使用 AD 相關的肽 tau（聚集體，300 μg/mL）或蛋白磷酸酶抑制劑 OKA (50 nM) 處理細胞。圖像顯示了在一次完整掃描中的活動范圍（最大/最小熒光反應）。鈣跡線顯示了視野內(nèi)所有活動對象的鈣水平波動。柱狀圖量化了活動對象的數(shù)量（1/圖）和關聯(lián)性（連接性）。這些數(shù)據(jù)顯示，與溶劑相比，tau 處理降低了活動節(jié)點的數(shù)量（1407 ± 94 對象/圖 vs. 920 ± 43 對象/圖），其平均強度分別為（13.7 ± 1.7 OCU vs. 7.2 ± 3.6 OCU），但 tau 處理不影響其關聯(lián)性（0.95 ± 0.01 vs. 0.97 ± 0.01, 2 次重復）。與之相反，OKA 降低了相較于溶劑，減少了活動節(jié)點的數(shù)量（180 ± 24 對象/圖）、平均強度（3.8 ± 0.3 OCU），以及關聯(lián)性（0.27 ± 0.02, 6 次重復）。數(shù)據(jù)表示為平均值 ± SEM。

圖 5. 2D 和 3D AD患者來源的 iPSC 模型顯示出明顯的神經(jīng)突發(fā)育和腫瘤球形成。將健康和 AD（PSEN1 突變）來源 iPSC 神經(jīng)元 (Axol Bioscience) 接種到鋪有 ReadySet + SureBond 的 96 孔板（2.5×10⁴ 個細胞/孔 (2D)），或ULA96 孔板中（5×10⁴ 個細胞/孔），然后離心（250 g；10 分鐘）。等待 3 天，使細胞形成腫瘤球?(3D)，并依照供應商的方案誘導神經(jīng)元分化（補充劑 A+B）。2D 研究：使用 Incucyte^? 軟件 (Sartorius) 自動定量神經(jīng)突發(fā)育 15 天。時間進程曲線顯示，AD患者來源的 iPSC 細胞系的神經(jīng)突長度比健康對照組更短（分別是 48 ± 3 mm/mm2，80 ± 3 mm/mm2，3 次重復）。3D 腫瘤球生長：使用明場分析以非干擾的方式定量球體大小差異15天。第 6 天在所選孔中加入 Matrigel^? (2.25 mg/mL)，然后對腫瘤球的形態(tài)和腫瘤球的發(fā)育過程進行 9 天的觀察。時間進程曲線顯示出兩種細胞系腫瘤球大小的明顯差異。圖像也顯示出健康細胞系和阿爾茲海默癥細胞系不同過程的發(fā)育能力。