支原體是最小的自由生存生物。它們屬于細(xì)菌類柔膜細(xì)菌目，其特征在于無(wú)細(xì)胞壁。因此，它們不受許多常用抗菌劑的影響。支原體是細(xì)胞培養(yǎng)中廣泛存在的污染物。由于支原體非常微?。s 0.3 - 0.8μm），無(wú)法用光學(xué)顯微鏡觀察到支原體污染，受感染細(xì)胞培養(yǎng)物中的生長(zhǎng)率和形態(tài)的改變會(huì)很小且不明顯。但是受支原體污染的產(chǎn)品會(huì)造成人類健康風(fēng)險(xiǎn)。所有這些都清楚地表明了對(duì)支原體常規(guī)檢測(cè)的高需求。

賽多利斯Microsart^? ATMP支原體檢測(cè)試劑盒能夠根據(jù)《歐洲藥典》2.6.7可靠、靈敏地檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)中和細(xì)胞培養(yǎng)衍生生物制品中的支原體DNA。

在本研究中，通過(guò)使用賽多利斯的定量CFU和GC標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)9種不同種類支原體基因組拷貝（GC）和菌落數(shù)（CFU）之間的相關(guān)性進(jìn)行了研究。由于PCR技術(shù)僅檢測(cè)基因組拷貝（GC），而不同的監(jiān)管部門，如韓國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局（KFDA）和日本藥品和醫(yī)療器械管理局（PMDA）要求在通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品質(zhì)量控制所用的檢測(cè)前要提供菌落數(shù)（CFU）與基因組拷貝（GC）的相關(guān)性。本研究的結(jié)果表明，盡管不同種類支原體間的基因組拷貝數(shù)不同，但都成功關(guān)聯(lián)了20 CFU或是40 CFU的比例相關(guān)性。

材料和方法

Microsart^? 支原體驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)品的DNA提取

Microsart^? 支原體驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)品的每一包裝包含3個(gè)小瓶，每個(gè)小瓶包含 10 CFU 所選支原體種類。將 250μl 杜氏最低營(yíng)養(yǎng)必需培養(yǎng)基（DMEM）+10%胎牛血清（FBS）加到兩個(gè)小瓶中，以制備一份濃度為 40 CFU/ml的懸浮液。將 500 μl DMEM +10%FBS加到一個(gè)小瓶中，以制備一份濃度為 20 CFU/ml的懸浮液。根據(jù)方案用Microsart^? AMP 提取試劑盒平行提取各細(xì)胞懸浮液的DNA。洗脫液直接用于Microsart^? ATMP 支原體qPCR 試劑盒檢測(cè)。

Microsart^? 校準(zhǔn)試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1：針對(duì)不同種類支原體的Microsart^? 支原體驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)品和Microsart^? 校準(zhǔn)試劑的產(chǎn)品概述。

為了量化Microsart^? 支原體驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)品的 DNA 提取物，有必要使用已知濃度的基因組拷貝（GC）建立一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。因此，使用了Microsart^? 校準(zhǔn)試劑。校準(zhǔn)試劑再水合后含特定細(xì)菌10? GC/μl 。在 Tris 緩沖液中制備稀釋梯度系列樣品，以使最終濃度達(dá)到5 GC/10μl 至 500 GC/10μl。

Microsart^? ATMP 支原體qPCR 試劑盒

對(duì)試劑盒里所有凍干組分再水化。針對(duì)一次反應(yīng)，將 15μl 的支原體混合物與 1μl 的內(nèi)標(biāo)對(duì)照 DNA 混合。將 15μl 該混合物加至每個(gè) PCR 管中。每次至少使用兩個(gè)無(wú)模板對(duì)照（NTC）進(jìn)行檢測(cè)，并且平行取樣兩份。因此，將 10μl 的樣本或 NTC 分別加至帶有反應(yīng)混合物的 PCR 管中。

在熒光定量 PCR 儀 CFX96 Touch Cycler（Bio-Rad；45 個(gè)周期，3min 95 ℃，30s 95 °，30s 55 ℃，45s 60 ℃）上進(jìn)行Microsart^? ATMP 支原體 qPCR 檢測(cè)。支原體DNA由一條FAM? 熒光通道中的增強(qiáng)熒光信號(hào)表示。在同一試管中的 ROX? 通道中檢測(cè)到內(nèi)標(biāo)對(duì)照DNA，該試劑盒用 FAM? 和 ROX? 雙探針來(lái)指示 PCR 檢測(cè)系統(tǒng)的正常無(wú)抑制。使用CFX Manager Software（Bio-Rad）進(jìn)行反應(yīng)分析?！稓W洲藥典》/《美國(guó)藥典》中列出的所有支原體種類的檢測(cè)限為≤10cfu/ml。

結(jié)果

圖2和3顯示了萊氏衣原體的示例性擴(kuò)增圖?；赾t值（FAM?通道）和標(biāo)準(zhǔn)濃度，CFX Manager軟件使用一個(gè)線性方程創(chuàng)建了一條標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）?；貧w系數(shù)0.983表明標(biāo)準(zhǔn)曲線良好。最優(yōu) qPCR 的效率為100%。在這種情況下，擴(kuò)增子 DNA 將在每個(gè)周期內(nèi)翻倍。根據(jù)對(duì) CFX 軟件的分析，萊氏衣原體的示例性 qPCR 運(yùn)行以101%的效率高效運(yùn)行（參見圖1中的效率）。

圖1：使用Microsart^? ATMP支原體試劑盒產(chǎn)生的最終基因組拷貝（GC）濃度5 GC/10μl至500 GC/10μl的萊氏無(wú)膽甾原體（Microsart^? 校準(zhǔn)試劑）的示例性標(biāo)準(zhǔn)曲線。

每個(gè)樣本和無(wú)模板對(duì)照（NTC）都顯示了內(nèi)標(biāo)對(duì)照DNA的一個(gè)擴(kuò)增，因此也造成了ROX?通道中的熒光信號(hào)（Ct<40；數(shù)據(jù)未示出）。表明了PCR檢測(cè)成功且無(wú)抑制。如預(yù)期，NTC在FAM?通道中未顯示熒光信號(hào)（參見圖2和圖3）。因此，表明了 PCR 反應(yīng)的無(wú)支原體制備無(wú)交叉感染。

圖2：Microsart^? ATMP支原體qPCR試劑盒生成的萊氏無(wú)膽甾原體的示例性擴(kuò)增圖。

圖3：Microsart^? ATMP支原體qPCR試劑盒生成的萊氏無(wú)膽甾原體的示例性擴(kuò)增圖。

已在所有樣本中成功檢測(cè)到20 CFU/ml 和40 CFU/ml 的每種支原體（測(cè)定LOD≤10cfu/ml；在試劑盒驗(yàn)證期間確定）。

基于標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程，軟件計(jì)算的支原體樣本GC濃度（20CFU/ml 和 40CFU/ml 提取物）。9 種不同種類支原體的平均GC/CFU比率如表2所示。

表2： 9種不同種類支原體的平均GC/CFU率

討論

在本研究中，使用賽多利斯定量 GC 和 CFU 標(biāo)準(zhǔn)研究了 9 種不同種類支原體的基因組拷貝（GC）和菌落數(shù)（CFU）之間的相關(guān)性。研究結(jié)果表明：GC 值高于 CFU 值。理論 GC:CFU 比率應(yīng)為1:1，因?yàn)槔硐肭闆r下，每個(gè)細(xì)胞應(yīng)檢測(cè)一個(gè)GC。實(shí)際上，即使在早期指數(shù)增生期就收獲支原體培養(yǎng)物，以防止在制劑中檢測(cè)到死細(xì)胞DNA，該比率也是不可實(shí)現(xiàn)的。出現(xiàn)非等比是因?yàn)榇罅康闹гw細(xì)胞不會(huì)在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)成菌落并不被檢測(cè)到（即，活的但非可培養(yǎng)的細(xì)胞）。此外，支原體細(xì)胞易于形成團(tuán)聚體，會(huì)被檢測(cè)為1個(gè)CFU，但實(shí)際上它結(jié)合了多個(gè)細(xì)胞，因此是好幾個(gè)GC。

這兩種情況都會(huì)嚴(yán)重低估細(xì)胞培養(yǎng)樣本中的真實(shí)支原體細(xì)胞數(shù)，因?yàn)橹挥幸徊糠旨?xì)胞會(huì)生長(zhǎng)為一個(gè)CFU。使用基于生長(zhǎng)的方法，不可培養(yǎng)的物種或可生存但不可培養(yǎng)的細(xì)胞可能導(dǎo)致假陰性的結(jié)果。由于基于生長(zhǎng)的方法中的假陰性結(jié)果而未檢測(cè)到支原體污染可能會(huì)產(chǎn)生具有潛在感染風(fēng)險(xiǎn)的不安全產(chǎn)品，特別是對(duì)于免疫缺陷的患者，這種風(fēng)險(xiǎn)會(huì)更嚴(yán)重。

總結(jié)

本研究表明：GC 和 CFU 之間的相關(guān)性可以成功地被證明，并且在驗(yàn)證期間易于實(shí)施證明試驗(yàn)。另外，可以通過(guò) PCR 的 GC 檢測(cè)顯示各樣本中實(shí)際污染水平的一個(gè)更真實(shí)結(jié)果，因此直接有利于藥物安全。

更多Microsart^??ATMP支原體試劑盒信息，

請(qǐng)點(diǎn)擊這里